• Interferencia de RNA. Los siRNAs

    From Francesc X. Blasco@2:343/107.14 to All on Wed Sep 19 00:17:08 2007
    Hello everybody.

    Si mi jefe de tesis me ve posteando sobre siRNAs en un foro, vamos lo flipa!! XDD

    Todos sabreis que básicamente somos proteina ( sí, y más basicamente aminoácidos pero no vamos tan abajo ;). El DNA codifica para las secuencias de AA de las diferentes proteinas que realizan una función. Para obtener una proteina, del DNA pasamos a un intermediario llamado mRNA (RNA mensajero) que sale del nucleo y se une a ribosomas ( orgánulos formados por otro tipo de RNA,
    el rRNA), dónde el tRNA ( o RNA de transferencia) aportará los AA indicados por
    el mRNA. Ejemplo computeril al uso: El DNA es código fuente y la proteina un ejecutable. El mRNA seria algo así como codigo objeto, el tRNA las librerías y en los Ribosomas se realizaría la compilación. Bueno, un poco patillero pero creo que lo habreis pillado, no? ( y si no preguntad, por favor!)

    DNA--->mRNA-----||---->mRNA---->mRNA+ribosoma+tRNA+AA---->Proteina
    Nucleo Citoplasma

    Como las proteinas son las encargadas de realizar funciones en el organismo, si
    queremos "eliminar" una función ( como la GlucoNeoGenesis en mi caso), hemos de
    suprimir, bloquear, silenciar, las proteinas encargadas de ello. Se puede actuar a nivel de la proteina con anticuerpos bloqueantes u otras proteinas, se
    puede actuar a nivel del DNA ( dónde hay las instrucciones de cómo hacer esa proteina) con mutaciones, delecciones, bloqueos de promotor,... O como en el caso de la Interferencia de RNA, podemos ir al intermediario, el mRNA y atacarlo antes que llegue a ribosoma y se fabrique la proteina.

    La diferencia de la Interferencia de RNA con otros métodos, es que la Interferencia aprovecha un mecanismo existente en las células, muy potente y eficiente, para regular y permitir el control fino de la expresión de determinados genes. Es un mecanismo que tiene gran amplificación de su respuesta y nos permite activarlo con cantidades bajas de siRNA ( small interference RNA). Estos siRNA son la clave del proceso. Son pequeños duplex de
    RNA de 2 cadenas de unos 20-22 nucleòtidos de largo. Una de esas cadenas es complementaria a la secuencia delmRNA que queremos silenciar ( complementaria significa que las secuencias de sus bases se complementan por parejas y por tanto se pueden unir. Os acordais de "Érase una vez la vida, los pequeños seres
    amarilos con una letra en la panza y la cabeza de formas distintas pero que se podian unir con otros bichos amarillos con cabezas complementarias? Pués eso ;)

    Cuando conseguimos introducir en una célula eucariota un siRNA complementario a
    un mRNA, se forma una doble cadena de RNA entre una de las cadenas de nuestri siRNA y el mRNA que queremos detruir. Para los que no lo sepais, una doble cadena de RNA no existe en nuestra biologia, y solo aparece en algunos virus. Se cree que el mecanismo de interferencia podría ser una reminiscencia de un primitivo mecanismo de defensa contra la infección por virus de doble cadena RNA, ya que está diseñado para activarse cuando dentro de la célula se encuentra una de estas dobles cadenas. Para ir abrebiando tan solo decir que al
    hibridarse, automáticamente se corta el mRNA haciéndose inutilizable( y por tanto se deja de producir la proteina y se empieza a perdrer la función para la
    cual esta proteina es necesaria,que es el objeto de todo esto), PERO nuestra secuencia original no se pierde, si no que se reutiliza, por tanto podemos ir silenciando gran númeor de cadenas de mRNA con una sola molécula de siRNA. De allí su gran potencia.

    Si alguien quiere más info que sepa que este mismo jueves en el Hotel Hesperia Tower ( sí, ese mastodonte de cemneto con platillo volante que está en la Gran Via cerca de IKEA) de Barcelona empiza el RNAi Europe, un congreso sobre interferencia de RNA. Así que si quereis profundizar sobre ello lo teneis "a huevo" los que seais de BCN :)

    Francesc

    --- GoldED+/LNX 1.1.5
    * Origin: Surcando los procelosos mares de Fidonet (2:343/107.14)
  • From Armando Perez@2:343/107.20 to Francesc X. Blasco on Wed Sep 19 13:07:30 2007
    ­Hola Francesc!

    El Mi‚rcoles 19 Septiembre 2007 a las 00:17, Francesc X. Blasco escribi¢ a All:

    Hello everybody.

    Si mi jefe de tesis me ve posteando sobre siRNAs en un foro, vamos lo flipa!! XDD

    Aqu¡ tambi‚n lo estamos flipando. :O Flipante... no me entero de nada. xD

    Pero bueno, que ... joer tio, eres una enciclopedia andante... pedazo de documentos... si se¤or.




    Armando Perez Abad
    Fidonet : 2:343/107.20
    Mail : ramones@kurarizeku.net
    majingazetto@gmail.com


    ... "binkd + hpt + GoldED + Mac OS X!"
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    * Origin: Armandin, Sora ni Sobieru (2:343/107.20)
  • From Chus Hernando@2:343/107.23 to Francesc X. Blasco on Sun Sep 23 20:17:44 2007
    ­Hola Francesc!

    El Mi‚rcoles 19 Septiembre 2007 a las 00:17, Francesc X. Blasco escribi¢ a All:

    Si mi jefe de tesis me ve posteando sobre siRNAs en un foro, vamos lo flipa!! XDD

    Seguramente, suena raro con tanto ciberespacio con descerebrados sueltos :D


    DNA--->mRNA-----||---->mRNA---->mRNA+ribosoma+tRNA+AA---->Proteina
    Nucleo Citoplasma

    Como las proteinas son las encargadas de realizar funciones en el organismo, si queremos "eliminar" una funci¢n ( como la
    GlucoNeoGenesis en mi caso), hemos de suprimir, bloquear, silenciar,
    las proteinas encargadas de ello. Se puede actuar a nivel de la
    proteina con anticuerpos bloqueantes u otras proteinas, se puede
    actuar a nivel del DNA ( d¢nde hay las instrucciones de c¢mo hacer esa proteina) con mutaciones, delecciones, bloqueos de promotor,... O como
    en el caso de la Interferencia de RNA, podemos ir al intermediario, el mRNA y atacarlo antes que llegue a ribosoma y se fabrique la proteina.

    ¨Es un s¢lo oper¢n o intervinen varias secuencias del DNA? Ya he le¡do que el estudio va por otro camino, actuando despu‚s de la replicaci¢n, es pura curiosidad.


    secuencia delmRNA que queremos silenciar ( complementaria significa
    que las secuencias de sus bases se complementan por parejas y por
    tanto se pueden unir. Os acordais de "rase una vez la vida, los
    peque¤os seres amarilos con una letra en la panza y la cabeza de
    formas distintas pero que se podian unir con otros bichos amarillos
    con cabezas complementarias? Pu‚s eso ;)

    Genial esa serie es genial :D


    una de estas dobles cadenas. Para ir abrebiando tan solo decir que al hibridarse, autom ticamente se corta el mRNA haci‚ndose inutilizable(
    y por tanto se deja de producir la proteina y se empieza a perdrer la funci¢n para la cual esta proteina es necesaria,que es el objeto de
    todo esto), PERO nuestra secuencia original no se pierde, si no que se reutiliza, por tanto podemos ir silenciando gran n£meor de cadenas de
    mRNA con una sola mol‚cula de siRNA. De all¡ su gran potencia.

    ¨C¢mo consigues que ese siRNA entre en todas las c‚lulas que puedan producir gluconeog‚nesis?

    Es un trabajo muy interesante.

    Si alguien quiere m s info que sepa que este mismo jueves en el Hotel Hesperia Tower ( s¡, ese mastodonte de cemneto con platillo volante
    que est  en la Gran Via cerca de IKEA) de Barcelona empiza el RNAi
    Europe, un congreso sobre interferencia de RNA. As¡ que si quereis profundizar sobre ello lo teneis "a huevo" los que seais de BCN :)

    Leches estar‚ fuera.



    Mar¡a Jes£s Hernando Julve
    Fidonet : 2:343/107.22
    Mail : maherjul@gmail.com


    ... "Ciencia es la creaci¢n de dilemas en un intento de resolver misterios." --- FMail/Win32 1.60
    * Origin: Teruel existe! (2:343/107.23)
  • From Chus Hernando@2:343/107.23 to Armando Perez on Sun Sep 23 20:27:40 2007
    ­Hola Armando!

    El Mi‚rcoles 19 Septiembre 2007 a las 13:07, Armando Perez escribi¢ a Francesc X. Blasco:

    Hello everybody.

    Si mi jefe de tesis me ve posteando sobre siRNAs en un foro,
    vamos lo flipa!! XDD

    Aqu¡ tambi‚n lo estamos flipando. :O Flipante... no me entero de nada.
    xD

    Consiste en leer :D

    Prueba otra vez :)

    Es un trabajo muy pero que muy interesante, espero que al final consiga¡s un tratamiento factible, al menos seguro que es menos agresivo que pincharse cada d¡a insulina.

    ¨De verdad no sirve para los tipo 1?



    Mar¡a Jes£s Hernando Julve
    Fidonet : 2:343/107.22
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    * Origin: Teruel existe! (2:343/107.23)
  • From Francesc X. Blasco@2:343/107.14 to Chus Hernando on Mon Sep 24 10:45:04 2007
    Hello Chus.

    Domingo 23 Septiembre 2007 20:17, you wrote to me:

    delecciones, bloqueos de promotor,... O como en el caso de la
    Interferencia de RNA, podemos ir al intermediario, el mRNA y
    atacarlo antes que llegue a ribosoma y se fabrique la proteina.

    ¿Es un sólo operón o intervinen varias secuencias del DNA? Ya he leído

    No me queda claro a qué te refieres. A la pepck, al siRNA, a los elementos del mecanismo de interferencia ( complejos proteicos encargados de su degradación: DICER, RISC,...)

    que el estudio va por otro camino, actuando después de la replicación,
    es pura curiosidad.

    La RNAi actua sobre la traducción, al igual que los antisense ( que se unen al mensajero como duplex dna-rna y bloquean su entrada en el ribosoma) y por tanto
    sí, actua después de la replicación.

    secuencia delmRNA que queremos silenciar ( complementaria
    significa que las secuencias de sus bases se complementan por
    parejas y por tanto se pueden unir. Os acordais de "Érase una vez
    la vida, los pequeños seres amarilos con una letra en la panza y
    la cabeza de formas distintas pero que se podian unir con otros
    bichos amarillos con cabezas complementarias? Pués eso ;)

    Genial esa serie es genial :D

    Y muy presente en la memoria de la gente. Si alguna vez he de explicar lo que hago, lo puedo hacer de forma muy simple pero siempre hace falta cierto background para entender cosas como "complementariedad de bases". Si en cambio les cuento que las bases y lo de ser complementarias es como los seres amarillos de "Erase una vez" casi todo el mundo lo entiende. Tienen muy fresca en su cabeza los bichos con letra y cabezas con pinchos que iban en una cinta y
    se enganchaban por la cabeza :) Resulta un ejemplo genial. Eso sirve para ver que esa série ha hecho mucho bién.

    ir silenciando gran númeor de cadenas de mRNA con una sola
    molécula de siRNA. De allí su gran potencia.

    ¿Cómo consigues que ese siRNA entre en todas las células que puedan producir gluconeogénesis?

    UUYYY!! :) Para el carro muchacha!! Eso ya es otro cantar y precísamente no es fácil. De echo es EL GRAN PROBLEMA. COmo conseguir dirigir un fármaco, terapia,
    molécula, a las células y solo a las células que lo necesitan?? En mi caso ,trabajo con cultivos celulares y se realiza por métodos de transfección basados en complejos lipídicos. Se forma un complejo lípido-molécula ( en mi caso siRNA) y se incuba junto con las células. Ese complejo facilita la entrada
    dentro del citoplasma y una vez allí el siRNA puede actuar. Hay experimentos en
    animales vivos, pero eso requeire de un poc más de sofisticación. Puede ser por
    formulaciones específicas de complejos que lleven tu molécula a un tejido concreto ( liposomas básciamente), pero hace años que se trabaja en eso y no és
    nunca totalemnte satisfactorio. También se usan vehículos biológicos, como por ejemplo virus con tropismo para nuestro tejido diana. Ahora ya estoy trabajando con ratones en eso y usamos una técnica de inyección (hydrodinamics)
    que nos permite llevar un gran volumen de nuestro siRNA al hígado ( el principal lugar de GNG) a través de la vena caudal. Pero incluso en el hígado necesitariamos llegar a una zona concreta y tenemos justamente el gradiente contrario, pero bueno, es lo mejor que podemos conseguir en este momento ^_^

    Es un trabajo muy interesante.

    Se agardece :)

    Francesc

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    * Origin: Surcando los procelosos mares de Fidonet (2:343/107.14)
  • From Armando Perez@2:343/107.20 to Francesc X. Blasco on Thu Sep 27 18:06:28 2007
    ­Hola Francesc!

    El Lunes 24 Septiembre 2007 a las 10:45, Francesc X. Blasco escribi¢ a Chus Hernando:

    No me queda claro a qu‚ te refieres. A la pepck, al siRNA, a los
    elementos del mecanismo de interferencia ( complejos proteicos
    encargados de su degradaci¢n: DICER, RISC,...)


    Mira mira Chus! Mira como si me entero!

    RISC: Reduced Instruction Set Computer.

    Eso es un tipo de micro, y de computadoras. XDDDDDDDDDDDDDDDDDDD

    ¨No es eso ciencia? :?

    No... va a ser que no ...

    Vaaaale... me callo. Pero es que vaya dos que os hab‚is juntado... pfff ... si no tuvi‚semos bastante con UN bi¢logo por aqu¡ ahora tenemos 2... xD

    (y Francesc, creo que Aitor el de ESP.MSX tambi‚n lo es XDDDDDD)



    Armando Perez Abad
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    ... "binkd + hpt + GoldED + Mac OS X!"
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    * Origin: Armandin, Sora ni Sobieru (2:343/107.20)
  • From Aitor Gonzaga@2:343/107.999 to Francesc X. Blasco on Thu Sep 27 20:12:28 2007
    Hola Francesc!

    Oye, una pasada el trabajo que estas realizando. Tengo algunas preguntitas, igual no tienen mucho sentido y las hago desde mi ignorancia sobre las bases moleculares y bla, bla de la diabetes.

    1 -¨El mecanismo de silenciamiento del RNAm, no tiene asociado ning£n tipo de respuesta inmune?

    2 -¨El mecanismo de acci¢n es similar al uso de nucle¢tidos antisentido, no?

    3 -¨el introducir un fragmento mas o menos grande de ARN de doble hebra, no induce la ap¢ptosis?

    4 -¨Los RNAi tienen pinta de ser una tratamiento prometedor como supresor de la
    replicacion del VIH no o incluso el cancer?

    AGM

    --- BBBS/NT v4.01 Flag
    * Origin: Eye of the Beholder BBS - FIDO <> HTTP Gateway (2:343/107.999)
  • From Francesc X. Blasco@2:343/107.14 to Aitor Gonzaga on Fri Sep 28 01:07:28 2007
    Hello Aitor.

    Jueves 27 Septiembre 2007 20:12, you wrote to me:

    Oye, una pasada el trabajo que estas realizando. Tengo algunas

    Gracias :) Aunque es más mérito del grupo que no mío.

    preguntitas, igual no tienen mucho sentido y las hago desde mi
    ignorancia sobre las bases moleculares y bla, bla de la diabetes.

    1 -¿El mecanismo de silenciamiento del RNAm, no tiene asociado ningún
    tipo de respuesta inmune?

    Existe. En un principio la técnica de RNAi se describió en plantas y organismos
    simples. Se pensaba que en cél·lulas eucariotas ese mecanismo no se podría utilizar de forma práctica ya que la presencia - y ahí recae el "truco"- de fragmentos de RNA 2ble cadena largos (>25nt) activava repsuesta inmune a través
    de la vía de Interferón.

    Hasta hace un par de años, se creia que los siRNA que comunmente se utilizan, todos alrededor de 21-23nt, NO producían respesta adversa en la célula. Pero se
    ha visto que no es así, y existe una dependencia secuencia-específica relacionada con la capacidad inmunoestimulatoria de un siRNA concreto. Eso tiene el efecto de tener que testar para una secuencia de siRNA que quieras utilizar en tus experimentos, no solo su eficiéncia silenciadora, sino también su inocuidad. El problema de la activación del Interferón no es que provoque apoptosis ( eso ya se hubiera visto fácilmente), si no que hay un semi arresto del ciclo y una parada en la maquinaria de síntesis proteica. Eso puede dar falsos positivos de silenciación si obtenemos por Western una menor cantidad de
    proteina en nuestras células vs las mismas transfectadas con un siRNA control. En vez de ver silenciación lo que estamos viendo es una parada generla en la produccion de nueva proteina.

    2 -¿El mecanismo de acción es similar al uso de nucleótidos
    antisentido, no?

    Como le contaba a Chus, se parece pero no es igual. En los Antisense normalmente se producen dúplex DNA-mRNA que bloquean la entrada de forma llamémosle "mecánica" al ribosoma. Así ese mRNA no puede traducirse y no hay proteina. Al rato esa cadena se degrada. Fíjate que en este caso estamos hablando de una relación 1:1 sonda vs target.

    En la RNAi, establecemos dúplex RNA-RNAm. Es este dúplex concreto que activa unos complejos proteicos que forman parte de una maquinaria bioquímica propia de la célula. Se pone en marcha, pués, un mecanismo _activo_ de destrucción por
    el complejo RISC que corta el RNAm y este se degrada. El fragmento RNA del siRNA que hemos usado _NO_ se destruye, si no que puede reutilizarse para redirigir de nuevo el complejo RISC a una nueva hebra de RNAm. Como ves, la potencia de este mecanismo en su ratio sonda vs target es mucho mayor.

    3 -¿el introducir un fragmento mas o menos grande de ARN de doble
    hebra, no induce la apóptosis?

    Tal y como te contaba en la respuesta 1. Por eso los siRNA usados son dúples pequeños de no más de 21-23nt ( y aún así es bueno comprobar que no hay efecto inmunoestimulatorio secuenciadependiente)

    4 -¿Los RNAi tienen pinta de ser una tratamiento prometedor como
    supresor de la replicacion del VIH no o incluso el cancer?

    Se estan usando en experimentos contra HIV y otros virus ( obviamente virus RNA
    son los candidatos optimos). Al respecto del cancer también hay aplicaciones. Allí donde queiras downregular la expresión de un marcador o enzima, tienes a los siRNA como una potente herramienta. Aún así, son muy utilizados en investigación, pero siguen teniendo el problema clásico de su distribución si quieres usarlos en terapia.

    Francesc

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    * Origin: Surcando los procelosos mares de Fidonet (2:343/107.14)
  • From Antonio Hernandez Lopez@2:343/107.4 to Armando Perez on Tue Oct 2 09:23:48 2007
    Hola Armando! v0.2b
    int main(Armando Perez,Francesc X. Blasco)

    Si mi jefe de tesis me ve posteando sobre siRNAs en un foro,
    vamos lo flipa!! XDD

    Yo ya lo he flipado ...

    Aquí también lo estamos flipando. :O Flipante... no me entero de nada.
    xD

    Pero bueno, que ... joer tio, eres una enciclopedia andante... pedazo
    de documentos... si señor.

    Pues eso, necesito traductor al castellano :D

    Saludos
    Belky

    ... El trabajo es el refugio de los que no tienen nada que hacer - Oscar Wilde --- crashmail + golded + binkd
    * Origin: Punto vampiro (2:343/107.4)
  • From Carlos Robinson@2:341/14.70 to Francesc X. Blasco on Thu Oct 4 14:36:24 2007
    Hola Francesc,

    El Mi‚rcoles 19 de Septiembre de 2, Francesc X. Blasco escribi¢ a All:

    Todos sabreis que b sicamente somos proteina ( s¡, y m s basicamente amino cidos pero no vamos tan abajo ;). El DNA codifica para las

    ...

    reutiliza, por tanto podemos ir silenciando gran n£meor de cadenas de
    mRNA con una sola mol‚cula de siRNA. De all¡ su gran potencia.

    Desde luego que no es mi campo, pero de algo me he enterado: resulta fascinante
    saber a que nivel se trabajan con estas cosas.


    Si alguien quiere m s info que sepa que este mismo jueves en el Hotel Hesperia Tower ( s¡, ese mastodonte de cemneto con platillo volante
    que est  en la Gran Via cerca de IKEA) de Barcelona empiza el RNAi
    Europe, un congreso sobre interferencia de RNA. As¡ que si quereis profundizar sobre ello lo teneis "a huevo" los que seais de BCN :)

    ­No gracias! X'-)

    Una cosa es que tenga curiosidad, a nivel divulgaci¢n cient¡fica, y otra asistir a un congreso serio en el que no me enterar¡a de casi nada - salvo de los caf‚s con pastas ;-)


    Saludos,
    Carlos

    --- GoldED+/LNX 1.1.4.7
    * Origin: B-{)# - Rafa STD - Linux+Golded+Hpt+Btxe/Binkd (2:341/14.70)